Môže to znieť ako značka cereálií, ale CRISPR predstavuje jednu z najvýznamnejších revolúcií v genetike počas nášho života. V posledných mesiacoch sa objavili príbehy o výskumných pracovníkoch, ktorí používajú proteíny CRISPR-Cas na účinnú úpravu genetických sekvencií DNA, zabíjanie HIV, „jesť Ziku ako Pac-man“ a uložiť GIF v DNA baktérií.
Napriek potenciálu CRISPR je to neuveriteľne kontroverzný postup. Vyžaduje to, aby boli reťazce DNA prerezané a úplne zmenené, aby sa zmenilo genetické zloženie človeka, a dve nové štúdie spojili takúto technológiu úpravy génov s nárastom rakoviny.
Papiere, jeden po druhom Novartis a druhý tým Karolínsky inštitút, Vydaný v Prírodná medicínadospeli k záveru, že techniky génovej terapie môžu oslabiť schopnosť človeka bojovať proti nádorom a „mohli by spôsobiť rakovinu, čo vyvoláva obavy o bezpečnosť génových terapií založených na CRISPR“.
Vráťme sa však trochu späť.
Pozri súvisiace
Tieto dva články sa zamerali na gén p53. Predchádzajúci výskum zistil, že niektoré ľudské nádory sa nemôžu vyvinúť, ak gén p53 funguje tak, ako má. Výsledkom je, že p53 pôsobí ako prirodzený obranný mechanizmus na ochranu genómu pred druhmi zmien, ktoré spôsobuje CRISPR-Cas9. Keď sa CRISPR-Cas9 použije na úpravu genetického zloženia človeka, gén p53 preskočí na jeho obranu a účinne zabíja upravené bunky tým, že spôsobí ich samodeštrukciu. V skutočnosti je to tento gén, ktorý oddialil pokrok a účinnosť techniky CRISPR v mnohých štúdiách.
Avšak v prípadoch, keď CRISPR-Cas9 úspešne upravil genóm človeka, naznačuje to, že gén p53 konkrétnej bunky je chybný alebo nefunkčný. To zase môže súvisieť s tým, že telo je menej schopné bojovať proti rakovine. Najmä chybný p53 môže spôsobiť bunky rástli „nekontrolovateľne a stali sa rakovinovými“ a spája sa s prípadmi rakovina vaječníkov, hrubého čreva a konečníka.
"Výberom buniek, ktoré úspešne opravili poškodený gén, ktorý sme chceli opraviť, by sme mohli." neúmyselne vyberajú aj bunky bez funkčného p53,“ autorka štúdie Emma Haapaniemi z Karolinska inštitútu vysvetlil. "Ak sa takéto bunky transplantujú pacientovi, ako pri génovej terapii dedičných chorôb, môžu spôsobiť rakovinu, čo vyvoláva obavy o bezpečnosť génových terapií založených na CRISPR."
Treba však poznamenať, že mať súvislosť s rakovinou nie je to isté ako spôsobiť rakovinu a jej následky dve štúdie sú známe ako „predbežné“, čo znamená, že je potrebná ďalšia práca na posilnenie alebo odmietnutie zistenia. Vedci sa dokonca rýchlo dištancujú od tvrdenia, že CRISPR je „nebezpečný“. Namiesto toho zvyšujú platné otázky a radí spoločnostiam a vedcom, ktorí sa chystajú pred klinickými skúškami, aby na to pamätali odkaz.
Štúdie sa zameriavajú aj na veľmi konkrétny typ techniky úpravy CRISPR – proteín Cas-9 používaný na nápravu chorôb DNA vložením „zdravej“, upravenej DNA – a je potrebná ďalšia práca, aby sa zistilo, či iné formy úpravy génov vytvárajú podobné obavy. V snahe riešiť podobné predchádzajúce kritiky výskumníci zo Salkovho inštitútu nedávno oznámili riešenie. Namiesto úpravy génov by ich takzvaná epigenetická (alebo „nad génom“) metóda CRISPR videla, že gény sa zapínajú alebo vypínajú, namiesto toho, aby boli odrezané.
Úpravou epigenómu boli vedci schopní kontrolovať správanie génu bez priamej úpravy akejkoľvek DNA; modifikácia génov skôr ako úprava génov. V pokusoch na myšiach vedci zvrátili príznaky ochorenia obličiek, cukrovky 1. typu a formy svalovej dystrofie. Má tiež potenciál na odstránenie Alzheimerovej choroby.
Čo je CRISPR-Cas9?
CRISPR-Cas9 je nástroj na úpravu genómu, ktorý dokáže cielene „rezať“ DNA, čo vedcom umožňuje presne upravovať stavebné kamene života. Pravdepodobne to uvidíte spomenuté spolu s o niečo menej známou dvojicou CRISPR-Cas1 a CRISPR-Cas2 – z ktorých obe spájajú kúsky DNA do vlastného genómu baktérie (viac o tom neskôr).
Cas9 bol v skutočnosti prvýkrát pozorovaný v osemdesiatych rokoch minulého storočia ako súčasť obranných mechanizmov jednobunkových baktérií, ktoré zaisťujú, že bunky sú schopné odstrániť nežiaducich votrelcov. Vedci zistili, že prispôsobením technológie sú schopní zacieliť na sekvencie genómu s bezprecedentnou rýchlosťou, presnosťou a presnosťou.
Predstavte si CRISPR-Cas9 ako vyhľadávanie „nájsť a nahradiť“ v počítačovom dokumente, len namiesto slov upravujete genetické sekvencie. Presná úprava DNA je vedecký svätý grál a potenciál je obrovský. Dalo by sa použiť na eradikáciu chorôb – dokonca aj dedičné choroby, ako je cystická fibróza, kosáčikovitá anémia a Huntingtonova choroba, by sa mohli stať minulosťou.
Názov CRISPR je skratka pre menej chytľavé „zhlukové pravidelne rozmiestnené krátke palindromické opakovania“. Časť „Cas“ odkazuje na „súvisiace s CRISPR“.
CRISPR-Cas9: Ako to funguje?
CRISPR je súčasťou prirodzene sa vyskytujúcej obranyschopnosti určitých baktérií. Keď baktéria zistí napadajúci vírus, je schopná skopírovať a zmiešať segmenty cudzej DNA do svojho vlastného genómu okolo CRISPR. Cas9 robí rez, zatiaľ čo Cas1 a Cas2 vkladajú vonkajšiu DNA do genómu bunky.
Keď sa nabudúce objaví vírus, CRISPR má presnú kópiu sekvencie genómu, ktorú treba hľadať, je miesto, kde prichádza proteín Cas: dokáže rozrezať DNA a vyradiť nežiaduce gény neuveriteľným spôsobom presnosť.
alebo ako vysvetľuje Carl Zimmer: „Keď sa oblasť CRISPR naplní vírusovou DNA, stáva sa molekulárnou najžiadanejšou galériou, ktorá predstavuje nepriateľov, s ktorými sa mikrób stretol. Mikrób potom môže použiť túto vírusovú DNA na premenu enzýmov Cas na presne navádzané zbrane. Mikrób skopíruje genetický materiál v každom spaceru do molekuly RNA. Enzýmy Cas potom prijmú jednu z molekúl RNA a uchytia ju. Spoločne sa vírusová RNA a enzýmy Cas presúvajú cez bunku. Ak sa stretnú s genetickým materiálom z vírusu, ktorý sa zhoduje s CRISPR RNA, RNA sa pevne prichytí. Enzýmy Cas potom rozsekajú DNA na dve časti, čím zabránia vírusu v replikácii.
V roku 2012 vedci z Kalifornskej univerzity v Berkeley publikovali a prelomový papier čo ukazuje, že boli schopní „preprogramovať“ imunitný systém CRISPR-Cas tak, aby upravoval gény podľa vlastného uváženia. CRISPR-Cas9 využíva špecifický Cas proteín a hybridnú RNA, ktorá dokáže identifikovať a upraviť akúkoľvek génovú sekvenciu. Možnosti sú obrovské.
Stručne povedané, CRISPR uvádza zoznam sekvencií DNA, ktoré sa majú zacieliť, a potom Cas9 vykoná rez. Vedcom stačí naprogramovať CRISPR so správnym kódom a Cas9 sa postará o zvyšok.
To by sa mohlo týkať aj „chybných“ génov – časti, ktoré v súčasnosti spôsobujú problémy, by sa dali odstrániť pomocou CRISPR-Cas9 a potom nahradiť zdravým genetickým kódom, čím by sa problém teoreticky vyriešil.
CRISPR-Cas9: Bol použitý na ľuďoch?
Áno, v Číne. Pomocou ľudských embryí získaných z kliniky plodnosti sa vedci pokúsili použiť CRISPR-Cas9 na úpravu génu, ktorý spôsobuje beta talasémiu v každej bunke. Je potrebné poznamenať, že použité darcovské embryá boli „neživotaschopné“ a nemohli viesť k živému pôrodu.
V každom prípade to zlyhalo a zlyhalo dosť zle: 86 embryí bolo injikovaných a po 48 hodinách a približne ôsmich bunkách prežilo 71 a 54 z nich bolo geneticky testovaných. Len 28 bolo úspešne spojených a len veľmi málo obsahovalo genetický materiál, ktorý výskumníci zamýšľali. "Ak to chcete urobiť v normálnych embryách, musíte byť blízko 100%," vedúci výskumník Povedal Jungiu Huang Príroda. "Preto sme prestali. Stále si myslíme, že je to príliš nezrelé."
Okrem toho je veľmi pravdepodobné, že došlo k viac nezdokumentovaným škodám. Ako New York Times vysvetľuje: “Čínski vedci poukazujú na to, že v ich experimente úpravy génov takmer určite spôsobili rozsiahlejšie škody, než zdokumentovali; neskúmali celé genómy embryonálnych buniek.“
Ako si viete predstaviť, vyvolalo to vo vedeckej komunite obrovské množstvo kontroverzií.
V novembri 2016, ďalšia skupina čínskych vedcov sa stala prvou, ktorá použila CRISPR-Cas9 na dospelom človeku, ktorý injekčne podal pacientovi s rakovinou pľúc imunitné bunky pacienta modifikované pomocou CRISPR, aby deaktivovali proteín PD-1, čo teoreticky prinúti telo pacienta bojovať proti rakovina.
Potom v a štúdium publikovaná 3. augusta, vedci úspešne „upravili“ ľudské embryá, odstránili chybný segment DNA, ktorý môže viesť k dedičnému ochoreniu srdca. Bol to prelomový úspech a poskytol možnosti na potenciálne prevenciu približne 10 000 genetických porúch s jednou mutáciou (t. j. chorôb spôsobených jedným chybným génom) u budúcich ľudí.
CRISPR-Cas9 a etika
Aj keď čínski vedci použili embryá, ktoré sa neplánovali vyvinúť do života, existujú skutočné etické obavy z experimentovania na ľudských embryách – skutočne len mesiac pred čínskym výskumom publikovaný, skupina amerických vedcov vyzvala svet, aby to nerobil.
Časť toho závisí od toho, aká nevyspelá je technológia – pamätajte, že sa aktívne používa len od roku 2012 a bolo by úžasné, keby bola v tomto bode úplne vyspelá. Vedci varovali, že v tomto bode je príliš nepochopený a nebezpečný na použitie na ľuďoch a čínsky výskum túto obavu určite potvrdzuje. Aj keby to fungovalo bezchybne, existujú obavy, že počas generácií by sa mohli vyskytnúť nepredvídané následky.
Ale aj keby to bolo 100% bezpečné a úspešné, existujú aj iné etické obavy: zatiaľ čo nikto netvrdí, že by sme mali brzdiť potenciál utierania CRISPR-Cas9 potenciálne ponúka príležitosť zmeniť čokoľvek na osoba. Pokiaľ je genetická sekvencia identifikovaná, teoreticky ju možno upravovať.
Jedna vec je odstrániť choroby ovplyvňujúce život ešte pred narodením – úplne iná je, keď rodičia dokážu navrhnúť svoje deti tak, aby boli silnejšie, rýchlejšie alebo lepšie vyzerajúce. Aj keď pripustíte, že toto je niečo, čo by ľudia mali mať dovolené robiť, je pravdepodobné, že by to bolo veľké komercializované, čím sa zabezpečí, že len bohatí si budú môcť dovoliť všetky ďalšie životné výhody, ktoré by si to dovolilo, čo výrazne ovplyvňuje nerovnosť.
CRISPR-Cas9: Čo sa doteraz urobilo?
Samozrejme, tieto etické otázky sú vzdialené milión míľ, keď jediný zaznamenaný embryonálny ľudský experiment spôsobil taký výrazný neúspech. CRISPR-Cas9 však teraz vykazuje mimoriadne sľubné výsledky v menších testoch.
Príklady zahŕňajú Prevencia infekcie HIV v ľudských bunkách, liečenie genetických chorôb myší a pár opíc narodených s cielenými mutáciami.
CRISPR sa tiež objavuje ako účinný prostriedok na ukladanie údajov v rámci DNA. V marci 2017 dvojica výskumníkov z New York Genome Center zverejnila správu v Veda žurnál, ktorý podrobne popisuje metódy ukladania komprimovaných súborov v molekulách DNA. S pomocou algoritmu na preklad súborov do binárneho kódu, ktorý možno mapovať na nukleotidové bázy DNA, výskumníkom sa podarilo zakódovať celkovo šesť súborov: akademický dokument z roku 1948, plaketu Pioneer, operačný systém, vírus, dokument z roku 1895 filmL’Arrivée d’un train en gare de La Ciotat…a darčeková karta Amazon v hodnote 50 dolárov.
O niekoľko mesiacov neskôr tím vedcov z Harvard Medical School zakódoval slučkový videoklip do DNA živej bunky baktérie E. Coli. Cieľom je vyvinúť systém výroby „molekulárne rekordéry“ – DNA, ktorá je schopná zaznamenávať vlastné informácie zo svojho okolia. To by sa dalo použiť vo všetkom, od monitorovania znečistenia pôdy až po revolúciu v našom chápaní neurologickej aktivity.
V rámci programu DARPA Safe Genes, sedem tímov zahŕňa a tím vedený Dr. Amitom Choudharym z Harvard Medical School, ktorý vyvíja spôsoby kontroly šírenia malárie komáre, druhý tím Harvardskej lekárskej fakulty, ktorý chce použiť CRISPR na detekciu a zvrátenie mutácií spôsobených žiarenia. Tím zo Štátnej univerzity v Severnej Karolíne pod vedením Dr. Johna Godwina sa zameriava na systémy génového pohonu u potkanov, aby ich zvládli invazívnych druhov, zatiaľ čo Kalifornská univerzita v Berkeley chce použiť CRISPR na zacielenie Zika a Ebola vírusy. Úplný zoznam projektov a podrobnosti o tíme sú k dispozícii na webovej stránke DARPA.
Nedávno zdieľal štrukturálny biológ Osamu Nureki z Tokijskej univerzity neuveriteľné zábery CRISPR upravujúceho DNA v reálnom čase, ktorý bol súčasťou nedávneho článku jeho tímu publikovaného v časopise Prírodné komunikácie. Klip nižšie ukazuje, ako CRISPR „hľadá“ DNA pred vykonaním úprav. Môžete vidieť, ako sa vlákno DNA odpája.
Zábery boli pôvodne zobrazené účastníkom podujatia CRISPR 2017 konferencii, ktorá sa konala v júni. Príspevok bol predložený po tejto konferencii a bol publikovaný 10. novembra.
CRISPR-Cas9: Príde do Veľkej Británie?
Áno. Výskumníci kmeňových buniek v UK požiadal o povolenie modifikovať ľudské embryá v snahe pochopiť skorý ľudský vývoj a znížiť pravdepodobnosť potratu. Vo februári 2016 sa Human Fertilization and Embryology Authority (HFEA) udelil povolenie.
CRISPR-Cas9: Prečo je CRISPR zlý?
Ako už bolo spomenuté, Cas9 dokáže rozpoznať iba genetické sekvencie dlhé približne 20 báz, čo znamená, že na dlhšie sekvencie nemožno zacieliť. Ešte dôležitejšie je, že enzým stále niekedy seká na nesprávnom mieste. Zistenie, prečo tomu tak je, bude samo o sebe významným prielomom – oprava bude ešte väčšia.
Potom je tu samozrejme problém, že CRISPR nefungoval veľmi dobre na ľudských embryách a jeho novšie súvislosti s rakovinou.
CRISPR-Cas9: Kto to vlastní?
Na to nie je jednoduchá odpoveď. Je predmetom prebiehajúcej patentovej bitky – prekvapivo vzhľadom na to, že CRISPR sa prirodzene vyskytuje v určitých baktériách.
Prehľad technológie vysvetľuje že hoci CRISPR-Cas9 bol prvýkrát opísaný v Veda v roku 2012 od Jennifer Doudna z UC Berkeley, Feng Zhang z Broad Institute získal patent na túto techniku predložením laboratórnych notebookov, ktoré dokazujú, že ju vynašiel ako prvý.
Patentové práva „prvý na podanie“ znamenajú, že by to malo byť udelené Doudnovi, ale rozhodnutie sa mohlo rozhodnúť na základe pravidiel „prvý vynájde“, čo by uprednostnilo Zhanga. Na koniec, Prípad bol vyriešený vo februári 2017, keď americký patentový súdny a odvolací výbor rozhodol, že UC Berkeley bude udelený patent na používanie CRISPR-Cas9 v akejkoľvek živej bunke, zatiaľ čo Broad by ho dostal v akejkoľvek eukaryotickej bunke – teda v bunkách rastlín a zvierat.
Snímky: Petra B Fritz, VeeDunn, Galéria obrázkov NIH, a Steve Jurvetson používané pod Creative Commons
